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Genbibliothek erstellen - (Gensuche, Identifizierung von Genen) – cDNA - [Gentechnik, 6/7]
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In diesem Video, welches eingebettet ist in eine Videoreihe zum Thema Gentechnik, schauen wir uns an, was man unter einer Genbibliothek versteht und wie man diese herstellt – und weil dabei auch Gensonden und cDNA eine Rolle spielen, klären wir natürlich auch, was es damit auf sich hat.
Die Herstellung einer Genbibliothek dient dem Zweck, bestimmte Gene zu identifizieren. Man ist also auf der Suche nach einem speziellen Gen in einem Lebewesen. Das Beispiel des Menschen, dessen gesamte, genomische DNA etwa 3 Milliarden Basenpaare umfasst und auf der sich schätzungsweise 80.000-140.000 Tausend Gene befinden zeigt, dass es bei der Identifizierung eines spezifischen Gens einem ebenso speziellen Verfahren bedarf, um aus der Vielzahl an Genen das eine gewünschte Gen zu ermitteln.
Das Erstellen einer Genbibliothek als ersten Teilschritt, ein Gen zu identifizieren - geschieht wie folgt: Nach der Extraktion der DNA aus der Zelle wird diese mithilfe von Restriktionsenzymen, die in der Lage sind, die DNA an spezifischen Stellen zu schneiden, in kürzere Fragmente geschnitten. Auch jetzt bleibt das gesamte Genom erhalten, nur, dass sich die Information auf viele kurze DNA-Fragmente verteilt. Im nächsten Schritt werden die kürzeren Fragmente in einen Vektor – einem Transportmolekül – eingebaut. Oft handelt es sich bei den Vektoren um Plasmide – kleine, ringförmige DNA von Bakterien wie auch hier abgebildet, aber auch Viren können als Vektoren fungieren. Durch den Einbau
Die so erzeugte rekombinante DNA – DNA aus mindestens zwei verschiedenen genetischen Ursprüngen wie hier z.B. einmal menschlichen Ursprungs und von Bakterien stammende DNA - wird in eine Wirtszelle– z.B. Escherichia Coli Bakterien – eingeschleust – ein Vorgang, der bei Bakterien als Wirtszellen auch Transformation genannt wird, die definiert ist als Mechanismus zur Übertragung genetischer Information in Bakterien. Die transformierte Zelle ist durch diesen Vorgang und die Aufnahme von fremder DNA (die des Menschen) zugleich eine transgene – gentechnisch veränderte – Zelle.
Diese einzelnen Wirtszellen werden im nächsten Schritt zu einer Kolonie vermehrt – jede Kolonie ist ein Klon identischer Zellen – umfasst also entsprechend viele Kopien eines winzigen Teils aus dem Genom. Auf diese Weise stellt man eine sogenannte Genbibiliothek her – quasi eine Bibliothek – eine Sammlung – von DNA-Fragmenten, die zusammen Teile oder die Gesamtheit des Genoms eines Organismus umfassen. Von der gesamten genomischen Bibliothek stellt ein einzelner Bakterienklon, der nur ein einzelnes DNA-Fragment enthält wie hier abgebildet, natürlich nur ein Buch in dieser Bibliothek dar. Jede einzelne Kolonie repräsentiert ein Buch – nimmt man die Bücher aller Kolonien zusammen, die alle zusammen die genomische DNA enthalten, erhält man die genomische Genbibliothek. Verwendet man Plasmide – also die ringförmigen DNA-Moleküle aus Bakterien -als Vektoren, sind etwa 700.000 Fragmente erforderlich, um eine Bibliothek des menschlichen Genoms herzustellen – bei Viren, die deutlich größere DNA-Fragmente aufnehmen können, sind immerhin noch 160.000 Fragmente erforderlich.
Eine deutlich kleinere Genbibliothek lässt sich aus komplementärer DNA (abgekürzt cDNA) herstellen – es handelt sich dabei um die komplementären Basenpaare der durch die Transkription erzeugten mRNA-Basensequenz. Die mRNA isoliert man aus Zellen und kopiert sie anschließend in komplementäre Basensequenz – und stellt so cDNA-Transkripte her. Das Enzym, das die Reaktion katalysiert, ist die Reverse-Transkriptase. Auf die gleiche Weise, wie man auch eine Genbibliothek herstellt, erzeugt man eine cDNA-Bibliothek. Heißt also: Integration der cDNA in Plasmide, Transformation der E.coli-Wirtszellen durch das Einschleusen der rekombinanten Plasmide in die Bakterienzelle und anschließende Vermehrung und dadurch Koloniebildung.
Die Herstellung einer Genbibliothek dient dem Zweck, bestimmte Gene zu identifizieren. Man ist also auf der Suche nach einem speziellen Gen in einem Lebewesen. Das Beispiel des Menschen, dessen gesamte, genomische DNA etwa 3 Milliarden Basenpaare umfasst und auf der sich schätzungsweise 80.000-140.000 Tausend Gene befinden zeigt, dass es bei der Identifizierung eines spezifischen Gens einem ebenso speziellen Verfahren bedarf, um aus der Vielzahl an Genen das eine gewünschte Gen zu ermitteln.
Das Erstellen einer Genbibliothek als ersten Teilschritt, ein Gen zu identifizieren - geschieht wie folgt: Nach der Extraktion der DNA aus der Zelle wird diese mithilfe von Restriktionsenzymen, die in der Lage sind, die DNA an spezifischen Stellen zu schneiden, in kürzere Fragmente geschnitten. Auch jetzt bleibt das gesamte Genom erhalten, nur, dass sich die Information auf viele kurze DNA-Fragmente verteilt. Im nächsten Schritt werden die kürzeren Fragmente in einen Vektor – einem Transportmolekül – eingebaut. Oft handelt es sich bei den Vektoren um Plasmide – kleine, ringförmige DNA von Bakterien wie auch hier abgebildet, aber auch Viren können als Vektoren fungieren. Durch den Einbau
Die so erzeugte rekombinante DNA – DNA aus mindestens zwei verschiedenen genetischen Ursprüngen wie hier z.B. einmal menschlichen Ursprungs und von Bakterien stammende DNA - wird in eine Wirtszelle– z.B. Escherichia Coli Bakterien – eingeschleust – ein Vorgang, der bei Bakterien als Wirtszellen auch Transformation genannt wird, die definiert ist als Mechanismus zur Übertragung genetischer Information in Bakterien. Die transformierte Zelle ist durch diesen Vorgang und die Aufnahme von fremder DNA (die des Menschen) zugleich eine transgene – gentechnisch veränderte – Zelle.
Diese einzelnen Wirtszellen werden im nächsten Schritt zu einer Kolonie vermehrt – jede Kolonie ist ein Klon identischer Zellen – umfasst also entsprechend viele Kopien eines winzigen Teils aus dem Genom. Auf diese Weise stellt man eine sogenannte Genbibiliothek her – quasi eine Bibliothek – eine Sammlung – von DNA-Fragmenten, die zusammen Teile oder die Gesamtheit des Genoms eines Organismus umfassen. Von der gesamten genomischen Bibliothek stellt ein einzelner Bakterienklon, der nur ein einzelnes DNA-Fragment enthält wie hier abgebildet, natürlich nur ein Buch in dieser Bibliothek dar. Jede einzelne Kolonie repräsentiert ein Buch – nimmt man die Bücher aller Kolonien zusammen, die alle zusammen die genomische DNA enthalten, erhält man die genomische Genbibliothek. Verwendet man Plasmide – also die ringförmigen DNA-Moleküle aus Bakterien -als Vektoren, sind etwa 700.000 Fragmente erforderlich, um eine Bibliothek des menschlichen Genoms herzustellen – bei Viren, die deutlich größere DNA-Fragmente aufnehmen können, sind immerhin noch 160.000 Fragmente erforderlich.
Eine deutlich kleinere Genbibliothek lässt sich aus komplementärer DNA (abgekürzt cDNA) herstellen – es handelt sich dabei um die komplementären Basenpaare der durch die Transkription erzeugten mRNA-Basensequenz. Die mRNA isoliert man aus Zellen und kopiert sie anschließend in komplementäre Basensequenz – und stellt so cDNA-Transkripte her. Das Enzym, das die Reaktion katalysiert, ist die Reverse-Transkriptase. Auf die gleiche Weise, wie man auch eine Genbibliothek herstellt, erzeugt man eine cDNA-Bibliothek. Heißt also: Integration der cDNA in Plasmide, Transformation der E.coli-Wirtszellen durch das Einschleusen der rekombinanten Plasmide in die Bakterienzelle und anschließende Vermehrung und dadurch Koloniebildung.
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